Knights Hospitaller yang dapat menghidu serangan luar akan melanda telah melakukan persiapan mengukuhkan pertahanan. Kemudian pada tahun 1557, para kesateria telah mengundi Jean Parisot de Valette untuk menjadi Grandmaster yang menaungi semua kesateria di Malta. Di bawah pimpinan Valette, kapal-kapal telah menambah armada perang untuk mengganti semula armada yang telah musnah di Djerba. Mereka mula memperkuat tiga kubu teras di Malta iaitu Saint Angelo, Saint Elmo dan Saint Michael. Lebih penting lagi, kesateria memulakan kegiatan rompakan di laut. Keberanian mereka di lautan telah mencabar dan memalukan Turki Uthmaniyah apabila kesateria ini berjaya menawan gabenor Uthmaniyah di Iskandariah dan Kaherah. Ancaman ini telah mempercepatkan usaha Sultan Sulaiman untuk menyerang kesateria di Malta.

Untuk merintis kepada serangan Malta, Sultan Sulaiman telah melantik wazir kepercayaannya, Mustafa Pasha sebagai komander pasukan tentera. Laksamana Piali Pasha dan Dargut juga bersama-sama dengannya. Kebanyakan sumber telah meletakkan jumlah kekuatan tentera Uthmaniyah ialah 40,000 orang. Mereka terdiri daripada 9,000 sipahi dan 6,300 tentera elit janissari sementara saki baki yang lain merupakan askar dari Afrika Utara dan kelasi kapal Dragut.

Grandmaster Valette terus mempersiapkan pertahanannya sementara menunggu pendaratan tentera-tentera Uthmaniyah. Kesemua bangunan yang terdapat di luar benteng pertahanan dan pelabuhan telah dimusnahkan untuk melenyapkan perlindungan bagi penembak tepat. Para petani pula diarahkan untuk memungut semua hasil tanaman dan membawanya ke benteng kubu. Hal ini untuk memastikan tanah yang gersang dan tandus ditinggalkan kepada penceroboh manakala bekalan tambahan telah dibawa masuk dari Sicily. Dengan menjangka bahawa tentera Uthmaniyah akan cuba mendarat di Birgu dahulu, Valette mengarahkan penduduknya berpindah ke kota yang terletak di kawasan pedalaman, Mdina. Buat masa ini, hanya kira-kira 500 orang kesateria yang ada untuk melindungi Malta dan disokong oleh 3,000 militia Malta. Penduduk asal Malta tidak terlalu berpihak kepada golongan kesateria yang mereka anggap sebagai penindas asing. Akan tetapi, mereka semua merupakan taat kepada ajaran Kristian dan bersama-sama mempertahankan tanah warisan ini menentang musuh Islam mereka. Pada 9 April, bantuan luar telah tiba yang membawa 1,000 tentera Sepanyol dan Itali Habsburg yang dihantar oleh Don Garcia del Toledo. Don Garcia memberitahu Valette bahawa beliau akan mengerahkan lebih banyak bantuan ketenteraan tetapi dalam jangka masa beberapa bulan lagi.